【摘要】 目的 观察新生大鼠氯胺酮麻醉后神经行为和海马谷氨酸 NMDAR 2 受体及转运体 GLAST 的远期改变。 方法 新生 1w Wistar 大鼠 40 只，随机均分为 4 组（ n=10 ）。 空白对照组 (CON) 不予任何干预；生理盐水组给予与氯胺酮同体积生理盐水； K100 组腹腔注射氯胺酮 100mg/kg/h ； K50 组腹腔注射氯胺酮 50mg/kg/h ，均持续麻醉 6h 。麻醉后 28d 进行旷场实验和 Morris 水迷宫实验，海马标本行 谷氨酸 NMDAR 2 受体及转运体 GLAST 免疫组织化学染色， 共聚焦显微镜观察并采集图象 , Image J 图象处理软件分析荧光半定量 OD 值。 结果 各组大鼠在旷场中央格的停留时间及穿越的方格数无明显差异（ P >0.05 ）。水迷宫测试各实验组的逃逸潜伏期均明显高于对照组（ P <0.05 ），探索时间短于对照组（ P <0.05 ），实验组之间差异不显著。 麻醉处理明显增加 NMDA R 2 和谷氨酸转运体 GLAST 的表达， K100 组和 K50 组之间 并无明显不同 。 结论 氯胺酮 麻醉新生大鼠可引起神经功能和 海马谷氨酸 NMDAR 2 受体及转运体 GLAST 的远期改变。

【关键词】 谷氨酸受体；谷氨酸转运体；海马；氯胺酮；免疫组织化学

Effects of ketamine on neuronal behavior and the expression of hippocampus glutamatergic receptor and transporter in neonatal rats Kuai Jian-ke, Yao li-nong, Yu Dai-hua, et al. Department of Anesthesiology, Tangdu Hospital, The Fourth Millitary Medical University, Xi'an, China, 710038

[Abstract] Objective To Observe the long-term changes of neuronal behavior and glutamatergic NMDAR2 and GLAST in neonatal rats after ketamine administration. Methods 40 neonatal 1w Wistar rats were randomly divided into four groups: Group control with no any treatment; Group NS administered equal volume NS for experimental control; Group K100 and Group K50 administered intraperitoneally ketamine 100mg and 50mg for 6h respectively. Open field and Morris water Maze were tested at 28d. Meanwhile, immunohistochemical techniques were implicated to observe the changes of NMDAR2 and GLAST at hippocampus. Results The retention time in central check and the locomotion of experimental groups were not significant different comparing with the control group （ P >0.05 ） . The escape latency of group K100 and group K50 was longer than control group (P<0.05)

基金项目：陕西省社会发展科技公关项目（ 2003G -K10 ）

作者单位： 710038 西安市，第四军医大学唐都医院麻醉科

责任作者：姚立农

and the spatial probe test shorter than group CON and group NS (P<0.05), but there was no significant difference between the group K100 and group K50. Ketamine increased the expression of NMDAR2 and GLAST at hippocampus compared with control group(P<0.05), but there was no difference between K100 and K50 group. Conclusion Ketamine induce Long-term changes of neuronal behavior and glutamatergic NMDAR2 and GLAST expression in neonatal rats.

[Key Words] glutamatergic receptor; glutamate transport; hippocampus; immunohistochemistry; ketamine

麻醉药是否影响发育期中枢神经系统（ CNS ）的正常发育一直是悬而未决而又具有重要意义的课题。传统观点推断各种麻醉药在体内的短暂作用不会引起神经元及其连接的病理改变，但缺乏实验观察依据。相反，近年许多研究发现在脑发育的关键阶段，动物神经元活性的短暂改变（过度激活或抑制）即可造成神经元形态和功能的异常，影响神经网络的构建 [1] 。脑爆发生长期应用改变神经元生理活性的 NMDA(N-methy-D-aspartate) 受体拮抗剂引起不同脑区广泛的凋亡性神经元退行性变。 本研究采用神经功能学和免疫组织化学的方法观察新生大鼠氯胺酮麻醉后空间辨别学习能力和海马谷氨酸 NMDAR2 受体及谷氨酸转运体 GLAST 的变化，为麻醉药的合理应用提供实验依据。

材料和方法

动物及麻醉处理 新生 1W Wister 大鼠 40 只，体重 18 -20g ，由西安第四军医大学实验动物中心提供。随机均分为 4 组（ n=10 ）。 空白对照组 (CON) 不予任何干预；生理盐水组：给予与氯胺酮同体积生理盐水； K100 组：腹腔注射氯胺酮 100mg/kg/h ，持续麻醉 6h ； K50 组：腹腔注射氯胺酮 50mg/kg/h ，持续麻醉 6h 。大鼠平卧在自制的麻醉箱中实施麻醉，用 i-STAT 血气分析仪监测大鼠尾血血气分析，用 Datex-Ohmeda F-MC 1 监护仪监测脉搏血氧饱和度仪测量 SPO 2 和心率。麻醉后与母鼠同窝饲养。

神经功能测试方法

1 ．旷场实验 旷场行为观察箱为 60cm × 60cm × 60cm 的无顶木箱 , 箱底用墨线分为 36 个等份小方格。麻醉后 3w 大鼠自中央格放入，观察在中央格停留时间和 2min 内穿越的格子数。

2 ． Morris 水迷宫实验 水迷宫为一直径 1.2 ｍ、高 0.5 ｍ圆桶，划为四个象限，盛水后按 0.5% ～ 1.5% 比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水温控制于 22 ～ 25 ℃ 。将一直径 10cm 平台固定于某一象限，平台在水平面下 1cm 。麻醉后 16d 开始水迷宫试验。程序包括①定位航行试验历时 5d ，每天上下午各 4 次，将大鼠从四个入水点面向池壁放入水中，记录 2min 内寻找平台的时间 ( 逃避潜伏期 ) ；②空间探索试验，将鼠任选一入水点放入水中，测其 2min 内在原平台处停留时间。

海马谷氨酸受体及谷氨酸转运体检测方法

1 ．动物取材 28d 时将大鼠开胸经左心室至升主动脉插管，先以 100ml 生理盐水冲洗血液，随后用冷的（ 4 ℃ ）含 40g /L 多聚甲醛的 0.1M 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ）先快后慢灌流固定 2h ，取脑置于 300g /L 蔗糖中（ 4 ℃ ）直至组织沉底，冰冻切片机连续冠状切片，片厚 30 μ m ，切片分套，置于 0.01M PBS 中存放。

2 ．免疫染色 取 2 套切片在 0.01M PBS 中漂洗后，入含 0.3% Triton X-100 的 0.01M PBS 中浸泡 30min （室温）。然后进行免疫组织化学荧光染色：（ 1 ）一组入兔抗 Glu 受体的抗体稀释液 (1:1000 ， Santa Cruz) ，另一组入豚鼠抗 GLAST 抗体稀释液 (1:1000 ， Santa Cruz), 两组切片均孵育 24h( 室温 ) ； (2) 加入驴抗兔 NMDAR2AB 抗体（ 1 ： 500,Chemicon ）和豚鼠抗 GLAST 抗体 (1 ： 800 ， Chemicon ) 混合抗体中 4 ℃ 孵 育 48h 。然后加入荧光二抗：抗兔 Texas-Red 和抗豚鼠 FITC （ 1 ： 500 ， Sigma ）避光孵育 2h 。 0.01M PBS 洗 3 次， 80% 甘油封片， Confocal 共聚焦显微镜下观察并采集图象 , Image J 图象处理软件分析荧光半定量 OD 值。

统计学处理 数据均以 x ± s 表示。采用 SPSS10.0 统计软件进行多因素方差分析及均数间的两两比较 , P <0.05 为差异显著。

结 果

氯胺酮麻醉对新生大鼠神经行为学的影响 各组大鼠在旷场中央格的停留时间及穿越的方格数无明显差异（ P >0.05 ），说明氯胺酮在本研究条件下并不明显影响大鼠的情感行为（表 1 ）。水迷宫测试各氯胺酮组的逃逸潜伏期均明显高于对照组（ P <0.05 ），寻找到平台的时间较长，经训练提高较慢。探索时间氯胺酮组短于空白对照组和生理盐水对照组（ P <0.05 ），大鼠常在四个象限无目的漫游。 K100 组和 K50 组之间差异不显著（表 1 ）。

氯胺酮麻醉对新生大鼠海马 NMDAR2 和 GLAST 表达的影响 氯胺酮 麻醉处理明显影响 NMDA 受体和谷氨酸转运体 GLAST 的表达。免疫荧光半定量的结果见图 1 。免疫电镜切片见图 2 。

讨 论

谷氨酸（ Glu ）是中枢神经系统 (CNS) 最主要的 兴奋性氨基酸递质，哺乳类前脑突触的 50% 以它们为神经递质，也是锥状神经元主要的神经递质。 NMDA(N-methy-D-aspartate) 受体是 CNS 内主要的谷氨酸阳离子通道， Na + 内流引起突触后去极化， Ca 2+ 内流触发一系列细胞内信号传导通路并产生相应的生物学效应。 NMDA 受体参与 CNS 发育过程的调控，可调节兴奋性突触的传递和发育过程中突触可塑性，并参与学习记忆的形成 [2] 。氯胺酮是一 NMDA 受体非竞争性拮抗剂，可降低突触前膜 Glu 释放。 另有许多研究证实，在哺乳类神经突触发生的关键期，应用 NMDA 受体拮抗剂可干扰 CNS 发育，引起神经元形态和功能异常 [3] 。

本研究用氯胺酮麻醉新生 1w 大鼠，在麻醉后 3w 观察到麻醉大鼠水迷宫逃逸潜伏期延长，探索时间缩短，提示麻醉大鼠与未麻醉大鼠的空间辨别学习和记忆能力出现差异。免疫组织化学证实大鼠海马 NMDAR2 受体和谷氨酸转运体 GLAST 表达增强，这种增强在 腹腔注射氯胺酮 100mg/kg/h 组和氯胺酮 50mg/kg/h 组之间 无明显不同。

研究表明应用 NMDA 受体拮抗剂会干扰中枢神经系统的发育。常用的 NMDA 受体拮抗剂如 MK-801 、 CPP 、苯环利啶、氯胺酮等，可影响神经递质合成酶的活性：在脑发育的一个特定时期（生后 10-19d ），可以观察到 MK-801 和 CPP 使小脑谷氨酰胺酶和天冬氨酸转移酶的活性明显下降，而且可使小脑颗粒层的厚度有轻微减少。由于谷氨酸能神经元在小脑发育的关键时期是促进小脑颗粒神经元分化的关键因子，如果 NMDA 受体拮抗剂干扰了其正常生理活性，必然引起神经元结构和功能的变化 [4] 。实验发现在中枢神经系统发育期如果改变 NMDA 受体的活性可影响中枢神经系统的发育和功能，出生后 2 周的仔鼠注射 NMDA 受体拮抗剂 AP 5 和 MK-801 可导致神经细胞出现异常轴突侧枝。如果在孕末期或出生后早期的几个小时内阻断了 NMDA 受体，将促使发育时期的大鼠脑出现广泛的神经变性、凋亡 [5] 。另有研究证实猴长期接触大剂量 NMDA 受体拮抗剂 Remacemide ，不但对学习能力有长期、持续的影响，而且如果在出生后 2 周内阻断 NMDA 受体，可出现大量凋亡性神经降解 [6] 。孕妇滥用苯环利啶影响胎儿脑发育也已有报道。条件性味觉厌恶实验显示氯胺酮会导致成年鼠对味觉厌恶的遗忘，说明 NMDA 受体拮抗剂损伤了动物的记忆功能 [7] 。

氯胺酮减少神经元突触 谷氨酸释放已为大量实验所证实 [8] ，国内赵秋华等用微透析法也证实氯胺酮剂量依赖性地抑制鼠大脑皮层谷氨酸的释放 [9] ，但 氯胺酮 增强 NMDAR2 受体和谷氨酸转运体 GLAST 的表达却未见报道。 NMDA 受体是离子型谷氨酸受体的一种，有 NMDAR1 、 NMDAR2 和 NMDAR3 三个亚单位 , NMDAR2 亚单位又可分为 NMDAR2A ~ D 四个亚型。原位杂交证实 NMDA 受体阻断剂 MK-801 和氯胺酮增加新生大鼠 NR1/NR 2A 、抑制 NR1/NR 2B 的重组表达，引起受体结构的变化 [10] 。 Nemeth 观察了新生鼠应用 MK-801 后的长期影响，发现生后 7-19d 大鼠注射 MK-801 2 次 / 日，每次 0.1mg/kg ， 90d 和 102d 分别行水迷宫和电生理测试，结果处理组出现学习能力损害和电生理可塑性的变化 [11] 。 Wilson 等研究发现给新生大鼠注射 MK-801 1mg/kg 后，大鼠皮质、海马 CA1 、 CA3 及齿状回 NR 2A 受体都有所增加，尤其是 CA1 区增加最明显，再注射 2mg/kg MK-801 NR 2A 的表达增加比 1mg/kg 更加明显，同时 NR1 及 NR2B 的表达在不同脑区也有不同程度的增加 [12] 。 Donald 等研究发现每日给予成年大鼠饲料加入 4-6%V/V 酒精 ( 非竞争性 NMDA 受体阻断剂 ) 喂养 10-12d 后发现大鼠大脑杏仁核底外侧及外侧 NR1 及 NR2B 受体表达增加 [13] 。

谷氨酸转运体在生理状态下，逆浓度差将胞外谷氨酸转运入神经细胞和胶质细胞内以防止突触间隙谷氨酸浓度上升而产生神经细胞毒作用。 目前已克隆出五种位于细胞膜的高亲和力谷氨酸转运体， GLAST 亚型是 脑内谷氨酸清除的主要转运体之一。本实验提示 Glu 转运体蛋白表达的增加可能与 Glu 摄取增多是一致的，最终可降低突触间隙 Glu 浓度。

在脑生长爆发期（人妊娠期后 3 月至出生后最初几年）， CNS 易受外界刺激干扰，在成年期表现出个体神经精神行为的异常 [12] 。研究麻醉药对发育期脑神经元影响的病理改变和机理，不但为临床孕产妇和婴幼儿麻醉的合理用药和发育毒性的预防治疗提供理论依据，而且，研究结果还有利于抗惊厥、抗癫痫、抗抑郁、酒精成瘾、吸毒等精神类药物的合理应用及治疗。

参考文献

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2 Hudspith MJ. Glutamate:Arole in normal brain function,anaesthesia,analgesia and CNS injury. Br J Anesth,1997;78:731-47

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5 Deutsch SI, Mastropaolo J, Rosse RB. Neurodevelopmental consequences of early exposure to phencyclidine and related drugs. Cli Neuropharmacol, 1998; 21(6):320-332

6 Doyle KM, Feerick S, Kirkby DL, et al. Comparison of various NMDA receptor antagnists in a model of short-term memory and on overt behavior. Behav Pharmacol, 1998;9(8):671-681

7 Doyle KM, Feerick S, Kirkby DL, et al. Comparison of various NMDA receptor antagnists in a model of short-term memory and on overt behavior. Behav Pharmacol, 1998;9(8):671-681

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9 赵秋华，岳云，于代华等。氯胺酮和咪唑安定麻醉下脑皮层谷氨酸含量的变化：活体脑微透析研究。临床麻醉学杂志， 2001 ， 17 （ 7 ）： 381-383

10 Buller AL, Larson HC, Schneider BE , et al. The molecular basis of NMDA receptor subtypes: native receptor diversity is predicted by subunit composition. J. Neurosci., Sep 1994; 14: 5471-5484.

11 Nemeth H, Varga H, Farkas T, et al. Long-term effecys of neonatal MK-801 treatment on spatial learning and cortical plasticity in adult rats. Psychopharmacology. 2002,160(1):1-8

12 Wilson MA.Expression of NMDA receptor subunite mRNA after MK-801 treament in neonatal rats.Developmental Brain Res.1998,109:211-220.

13 Donald W. Ki YJ. Chronic ethanol ingestion facilitates NMDA receptor function and expression in rat lateral/basolateral amygdala Neurons. The Journal of Pharmacology and Experiment Therapeutics.2003, 329:1020-1029.

图 1 各实验组 NMDAR2 和 EAAT 免疫荧光 OD 值的变化

CON ：空白对照组； NS ：生理盐水组 ; K100 ： 氯胺酮 100mg/kg 组 ; K50 ：氯胺酮 50mg/kg 组