| 【摘要】 目的 观察新生大鼠异氟醚麻醉后神经行为和海马谷氨酸 NMDAR 2 受体及转运体 GLAST 的远期改变。 方法 新生 1w Wistar 大鼠 40 只，随机均分为 5 组（ n=8 ）。 空白对照组 (A 组 ) 不予任何干预； B 组和 C 组：分别吸入 1.8 ％和 1.2% 异氟醚麻醉 6h ； D 组和 E 组：分别吸入 1.8 ％和 1.2% 异氟醚麻醉 3 次， 1 次 / 日， 2h/ 次。麻醉后 28d 进行旷场实验和 Morris 水迷宫实验，海马标本行 谷氨酸 NMDAR 2 受体及转运体 GLAST 免疫组织化学染色， 共聚焦显微镜观察并采集图象 , Image J 图象处理软件分析荧光半定量 OD 值。 结果 各组大鼠在旷场中央格的停留时间及穿越的方格数无明显差异（ P >0.05 ）。水迷宫测试各实验组的逃逸潜伏期均明显高于对照组（ P <0.05 ），探索时间短于对照组（ P <0.05 ），各实验组之间差异不显著。各种 麻醉处理明显增加 NMDA R 2 和谷氨酸转运体 GLAST 的表达， 1.8% 异氟醚麻醉组又明显高于 1.2% 异氟醚麻醉组 （ P <0.05 ）， 单次麻醉和多次麻醉并无明显不同 。 结论 异氟醚 麻醉新生大鼠可引起神经功能和 海马谷氨酸 NMDAR 2 受体及转运体 GLAST 的远期改变。
【关键词】 谷氨酸受体；谷氨酸转运体；海马；异氟醚；免疫组织化学
Effects of isoflurane on neuronal behavior and the expression of hippocampus glutamatergic receptor and transporter in neonatal rats Kuai Jianke, Yao linong, Yu Daihua, et al. Department of Anesthesiology, Tangdu Hospital , The Fourth Millitary Medical University , Xi'an , China , 710038
[Abstract] Objective To Observe the long-term changes of neuronal behavior and glutamatergic NMDAR2 and GLAST in neonatal rats after anesthesized by isoflurane. Methods 40 neonatal 1w Wistar rats were randomly devided into the following groups: Group A with no any treatment as control; Group B and Group C were anesthetized with 1.8% and 1.2% isoflurane for 6h respectively; Group D and Group E were anesthetized with 1.8% and 1.2% isoflurane for 2h and repeated 3 times within 3 days respectively. Open field and Morris water Maze were tested at 28d. Meanwhile, immunohistochemical techniques were implicated to observe the changes of NMDAR2 and GLAST at hippocampus. Results The retention time in central check and the locomotion of experimental groups were not significant different comparing with the control group （ P >0.05 ） . The escape latency
基金项目：陕西省社会发展科技公关项目（ 2003G 4-K10 ）
作者单位： 710038 西安市，第四军医大学唐都医院麻醉科
time in each treated groups was longer than control group (P<0.05) and the spatial probe test shorter than control group (P<0.05), but there was no significant difference among the treated groups. Isoflurane increased the expression of NMDAR2 and GLAST at hippocampus compared with control group, especily in 1.8% isoflurane anesthetized groups (P<0.05). There was no difference between single and repeatedly anesthetic style. Conclusion Isoflurane can induce Long-term changes of neuronal behavior and glutamatergic NMDAR2 and GLAST expression in neonatal rats.
[Key Words] glutamatergic receptor; glutamate transport; hippocampus; immunohistochemistry; isoflurane
异氟醚对新生大鼠神经功能和海马谷氨酸受体及转运体表达的影响
蒯建科 姚立农 于代华 杨永慧 张凤林 柴伟
学习和记忆是动物和人类赖以生存所不可缺少的脑功能。婴幼儿阶段是脑发育成熟的关键时期。长时间、反复使用麻醉药是否引起婴幼儿中枢神经系统神经元结构和功能的改变？是否影响婴幼儿的学习和记忆能力？此问题倍受关注。兴奋性谷氨酸神经递质及其 NMDA 受体参与和调节中枢神经系统的发育并与学习和记忆有关。全身麻醉药以抑制兴奋性突触传递为主要作用机理之一。本研究采用神经功能学和免疫组织化学的方法观察新生大鼠异氟醚麻醉后空间辨别学习能力和海马 NMDAR 2 受体及谷氨酸转运体 GLAST 的变化，以期为麻醉药的合理应用提供实验依据。
材料和方法
动物及麻醉处理 ：新生 1W Wister 大鼠 40 只，体重 18 -20g ，由西安第四军医大学实验动物中心提供。随机均分为 5 组（ n=8 ）。 空白对照组 (A 组 ) 不予任何干预； B 组和 C 组：分别吸入 1.8 ％和 1.2% 异氟醚麻醉 6h ； D 组和 E 组：分别吸入 1.8 ％和 1.2% 异氟醚麻醉 3 次， 1 次 / 日， 2h/ 次。大鼠平卧在自制的麻醉箱中实施麻醉， Datex-Ohmeda F-MC 1 气体监测仪控制流出气体中异氟醚浓度同时测量 SPO 2 和心率， i-STAT 血气分析仪监测大鼠尾血血气分析。麻醉后与母鼠同窝饲养。
神经功能测试： 1. 旷场实验 旷场行为观察箱为 60cm × 60cm × 60cm 的无顶木箱 , 箱底用墨线分为 36 个等份小方格。麻醉后 3w 大鼠自中央格放入，观察在中央格停留时间和 2min 内穿越的格子数。 2. Morris 水迷宫实验 水迷宫为一直径 1.2 ｍ、高 0.5 ｍ圆桶，划为四个象限，盛水后按 0.5% ～ 1.5% 比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水温控制于 22 ～ 25 ℃。将一直径 10cm 平台固定于某一象限，平台在水平面下 1cm 。麻醉后 16d 开始水迷宫试验。程序包括①定位航行试验，历时 5d ，每天上下午各 4 次，将大鼠从四个入水点面向池壁放入水中，记录 2min 内寻找平台的时间 ( 逃避潜伏期 ) ；②空间探索试验，将鼠任选一入水点放入水中，测其 2min 内在原平台处停留时间。
海马谷氨酸受体及谷氨酸转运体检测： 1. 动物取材 28d 时将大鼠开胸经左心室至升主动脉插管，先以 100ml 生理盐水冲洗血液，随后用冷的（ 4 ℃ ）含 40g /L 多聚甲醛的 0.1M 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ）先快后慢灌流固定 2h ，取脑置于 300g /L 蔗糖中（ 4 ℃ ）直至组织沉底，冰冻切片机连续冠状切片，片厚 30 μ m ，切片分套，置于 0.01M PBS 中存放。 2. 免疫染色 取 2 套切片在 0.01M PBS 中漂洗后，入含 0.3% Triton X-100 的 0.01M PBS 中浸泡 30min （室温）。然后进行免疫组织化学荧光染色：（ 1 ）一组入兔抗 Glu 受体的抗体稀释液 (1:1000 ， Santa Cruz) ，另一组入豚鼠抗 GLAST 抗体稀释液 (1:1000 ， Santa Cruz), 两组切片均孵育 24h( 室温 ) ； (2) 加入驴抗兔 NMDAR2AB 抗体（ 1 ： 500,Chemicon ）和豚鼠抗 GLAST 抗体 (1 ： 800 ， Chemicon ) 混合抗体中 4 ℃ 孵 育 48h 。然后加入荧光二抗：荧光素得克萨斯红标记的抗兔 (1 ∶ 500,Sigma) 和 FITC 标记的抗豚鼠 IgG(1 ∶ 500,Sigma) 抗血清室温避光孵育 2h 。 0.01M PBS 洗 3 次， 80% 甘油封片， Confocal 共聚焦显微镜下观察并采集图象 , Image J 图象处理软件分析荧光半定量 OD 值。
统计学处理 ：数据均以 x ± s 表示。采用 SPSS10.0 统计软件进行多因素方差分析及均数间的两两比较 , P <0.05 为差异显著。
结 果
异氟醚麻醉对新生大鼠神经行为学的影响 各组大鼠在旷场中央格的停留时间及穿越的方格数无明显差异（ P >0.05 ），说明各麻醉方式并不明显影响大鼠的情感行为（表 1 ）。水迷宫测试各实验组的逃逸潜伏期均明显高于对照组（ P <0.05 ），寻找到平台的时间较长，经训练提高较慢。探索时间短于对照组（ P <0.05 ），大鼠常在四个象限无目的漫游。各实验组之间差异不显著（表 1 ）。
异氟醚麻醉对新生大鼠海马 NMDAR 2 和 GLAST 表达的影响 各种 麻醉处理明显增加 NMDA 受体和谷氨酸转运体 GLAST 的表达。免疫荧光半定量的结果见图 1 。免疫电镜切片见图 2 。
讨 论
谷氨酸（ Glu ）是中枢神经系统 ( ＣＮＳ ) 最主要的兴奋性神经递质 , 对正常脑功能和ＣＮＳ的发育发挥重要的调节作用。 现认为全身麻醉药（尤其吸入麻醉药）可通过抑制突触前谷氨酸的释放、增强谷氨酸的再摄取及阻滞突触后兴奋性氨基酸受体而发挥全麻作用 [1] 。同时， 谷氨酸 NMDA 受体参与 CNS 发育过程的调控也已为大量实验所证实，可调节兴奋性突触的传递和发育过程中突触可塑性，并参与学习和记忆的形成。另有许多研究证实，在哺乳类神经突触发生的关键期，应用 NMDA 受体拮抗剂可干扰 CNS 发育，引起神经元形态和功能异常 [2] 。那么，临床麻醉药物是否影响婴幼儿中枢神经系统的正常发育过程呢？
本研究用临床麻醉浓度异氟醚吸入方法麻醉新生 1w 大鼠，在麻醉后 3w 观察到麻醉大鼠水迷宫逃逸潜伏期延长，探索时间缩短，提示麻醉大鼠与未麻醉大鼠的空间辨别学习和记忆能力出现差异。免疫组织化学证实大鼠海马 NMDAR 2 受体和谷氨酸转运体 GLAST 表达增强，这种增强在 1.8% 异氟醚组又明显高于 1.2% 异氟醚组，单次麻醉和多次麻醉并无明显不同。
已有研究发现全身麻醉药可引起发育期中枢神经细胞的损伤同时伴有神经功能的改变。 Jevtovic-Todorovic 等 [3] 应用临床常用的咪唑安定 / 笑气 / 异氟醚麻醉方式，麻醉 7d 大鼠达到手术要求深度并持续 6h ，发现几个主要脑区（丘脑、下丘脑、杏仁核、尾状核、额叶、顶叶、颞叶、扣带回、海马和大脑下脚）出现明显的凋亡性神经变性，而且 30d 时学习和记忆及突触长时程增强（ LTP ）测试均明显受损，持续到 130d 仍存在。 Vesna 对成年大鼠异氟醚 / 笑气连续麻醉 3h ，发现大脑皮层细胞出现明显的组织病理学改变。 Kotiniemi 等采用问卷调查的方法，由患儿父母评价术后 1 天、 1 周和 1 月的行为学变化，发现硫喷妥钠组有 59% 、氟烷组有 50% 、甲基戊巴比妥组有 58% 出现过行为的异常改变 [4] 。 Kaech 等证实吸入麻醉药异氟醚在临床应用浓度下，可通过阻断肌纤蛋白的聚合作用消除神经元树突棘的形态变化 [5] 。
异氟醚减少神经元突触 谷氨酸释放、增加谷氨酸摄取已为大量实验所证实，国内赵秋华等用微透析法也证实异氟醚剂量依赖性地抑制鼠大脑皮层谷氨酸的释放 [6] ，但 异氟醚 增强 NMDAR 2 受体和谷氨酸转运体 GLAST 的表达却未见报道。 NMDA 受体是离子型谷氨酸受体的一种，有 NMDAR 1 、 NMDAR 2 和 NMDAR 3 三个亚单位 , NMDAR 2 亚单位又可分为 NMDAR 2A~D 四个亚型。原位杂交证实 NMDA 受体阻断剂 MK-801 和氯胺酮增加新生大鼠 NR 1 /NR 2A 、抑制 NR 1 /NR 2B 的重组表达，引起受体结构的变化 [7] 。 Nemeth 观察了新生鼠应用 MK-801 后的长期影响，发现生后 7-19d 大鼠注射 MK-801 2 次 / 日，每次 0.1mg/kg ， 90d 和 102d 分别行水迷宫和电生理测试，结果处理组出现学习能力损害和电生理可塑性的变化 [8] 。 Wilson 等研究发现给新生大鼠注射 MK-801 1mg/kg 后，大鼠皮质、海马 CA1 、 CA3 及齿状回 NR 2A 受体都有所增加，尤其是 CA1 区增加最明显，再注射 2mg/kg MK-801 NR 2A 的表达增加比 1mg/kg 更加明显，同时 NR1 及 NR2B 的表达在不同脑区也有不同程度的增加 [9] 。 Donald 等研究发现每日给予成年大鼠饲料加入 4-6%V/V 酒精 ( 非竞争性 NMDA 受体阻断剂 ) 喂养 10-12d 后发现大鼠大脑杏仁核底外侧及外侧 NR 1 及 NR 2B 受体表达增加 [10] 。
谷氨酸转运体在生理状态下，逆浓度差将胞外谷氨酸转运入神经细胞和胶质细胞内以防止突触间隙谷氨酸浓度上升而产生神经细胞毒作用。 目前已克隆出五种位于细胞膜的高亲和力谷氨酸转运体， GLAST 亚型是 脑内谷氨酸清除的主要转运体之一。对大鼠脑皮层突触体的研究表明， 1.5% 和 3% 的异氟醚可显著增加高亲和性转运体对 Glu 的摄取，其 V max 分别是对照值的 131% 和 210% ，从而使突触间隙 Glu 的递质减少 [11] ，本实验提示 Glu 转运体蛋白表达的增加可能与 Glu 摄取增多是一致的。
研究表明，在脑生长爆发期（人妊娠期后 3 月至出生后最初几年）， CNS 易受外界刺激干扰，在成年期表现出个体神经精神行为的异常 [12] 。目前的研究从神经行为学和免疫组织化学证实麻醉药 异氟醚 可引起神经元及突触和相应受体可塑性变化，但其机制仍需深入研究。麻醉药是否影响婴幼儿神经元生长、分化、成熟等一系列环节的某个（某些）过程，从而产生远期可塑性的变化，进而影响智力发育是需深入研究的重要课题。
参考文献
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3 Jevtovic-Todorovic V, Hartman RE, Izumi Y, et al. Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistend learning deficits. J Neurosci, 2003, 23(3):876-882
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